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        GPCR穩定細胞株的基本篩選方法
        點擊次數:290 發布時間:2022-07-12
           GPCR穩定細胞株一般是將外源DNA克隆到具有某種抗性或選擇基因的載體上,載體被轉染到宿主細胞并整合到染色體中,用載體中所含的選擇標志進行篩選,篩選得到可穩定表達目的蛋白的細胞株。廣泛應用于重組蛋白、抗體生產、檢測分析、免疫治療藥物開發等研究領域。表達的蛋白/抗體穩定性更好,批次間差異小,是生物醫藥研發的基礎。
         
          GPCR穩定細胞株的篩選:
         
          方法一:先把質粒整合到染色體上后,用相應的質粒DNA中的抗性標志來篩選該細胞系,單克隆篩選穩定細胞株。
         
          第一步:篩選濃度測定,以10~14天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度;
         
          第二步:進行細胞接種,轉染實驗前天接種細胞,各種細胞的平板密度依據各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉染當天細胞密度應達到60%~80%覆蓋;
         
          第三步:進行細胞轉染
         
          第四步:利用質粒上含有的抗性選擇進行篩選,并鑒定篩選結果。
         
          方法二:應用逆轉錄病毒,慢病毒轉染,篩選穩定細胞株。慢病毒可以攜帶外源基因隨機整合進基因組。轉染得到穩定細胞株的效率高,是建立穩定株的*方式。
         
          第一步:將人源化的抗體基因轉接到慢病毒載體上,
         
          第二步:使用包裝細胞,一般為293細胞,包裝出病毒,不同類型病毒包裝時間一般在3-5天。
         
          第三步:用病毒轉染目的細胞。包裝好的病毒要先測滴度,根據滴度決定轉染目的細胞的病毒量。
         
          第四步:后期篩選。轉染目的細胞1-2天后加抗生素篩選得到穩定細胞株。
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